Ciência desleixada ou ideia inovadora? – Alfredo Martinho.

Os cientistas também precisam de paciência!

A pressa e o açodamento em busca de respostas e soluções rápidas para os problemas que vivenciamos nesses últimos meses, embora bastante compreensíveis, precisam de um constante “freio de arrumação” metodológico e cognitivo.

Esse “frenesi veloz” infiltrou totalmente “nossos pensamentos, nossas palavras e obras…” e, transversalmente a atuação política diante do fato (pandemia) repercutindo intensamente no comportamento individual e coletivo.

As pesquisas que já vinham sendo elaboradas nos últimos anos, foram alavancadas pelo financiamento repentinamente disponível, abreviando muitas etapas de seus processos.

Os exemplos mais visíveis foram nas pesquisas de vacinas, que normalmente demoram 15 anos para serem desenvolvidas, sendo abreviadas para 10 meses, como a vacina de Oxford para Covid-19.

Muito embora, esse trabalho tenha começado há 10 anos, quando esse mesmo grupo pesquisava vírus de chimpanzé que poderiam ser “hackeados” para expressarem uma proteína de outro agente infeccioso e assim induzirem a imunidade em humanos. A partir do entendimento desse sistema, foi permitido o desenvolvimento rápido de vacinas para diferentes doenças, apenas trocando-se a proteína do agente infeccioso. Já havia sido demonstrado tolerabilidade e segurança no uso desse vetor, tendo sido usada em desenvolvimento de outras vacinas como Ebola, Zika, HPV, Hepatite B, Tuberculose, HIV e Chickungunya.

Nem tudo, porém foram flores, vários trabalhos feitos às pressas e, como já de amplo conhecimento que, mesmo periódicos científicos reconhecidos, erraram na mão curadora de seus editores, alguns desses editores, vieram a público esclarecer e pedir velada desculpa pela publicação de estudos mal desenhados e malconduzidos.

Em outro artigo publicado aqui em nosso conteúdo selecionado, pudemos constatar o que pode ser chamado de má ciência – sim, existe a má ciência e, isso também aconteceu nos últimos meses quando vazaram diversos pré prints de trabalhos malconduzidos, não revisados, que apareceram distribuídos pela imprensa e redes sociais como verdades absolutas.

Esse artigo que apresento hoje com grifo das partes que julguei importantes, demonstram que a pesquisa básica, clínica e translacional, assim como os interesses diversos, na nomeação da primazia dos achados, muitas vezes atropelam o que poderíamos conceituar de boa ciência, antecipando soluções que deveriam ser submetidas a um permanente escrutínio e revisão crítica.

Me lembrei nos idos de 1985, em minha passagem pelo Brigham and Woman, assistindo pela manhã as microcirurgias de reconstrução tubária que o professor Robert Kistner efetuava em pacientes referenciadas de toda New England e, à tarde, frequentando o laboratório de citologia (eu tinha um “Grant” como auxiliar), conversava diariamente no café com um pesquisador indiano, em pós doutorado, do Dana Faber Cancer Institute, que me ensinava, naqueles idos, sobre a biologia molecular e seu “timing” e não a genética, como chave para entender melhor os mecanismos celulares.

O tema de hoje é sobre uma questão fundamental que incomoda os biólogos há mais de 100 anos: como as células organizam seu conteúdo de forma que as moléculas necessárias para realizar um trabalho específico estejam no lugar certo na hora certa?

Esse artigo publicado no Science, anteontem, dia 21 de janeiro de 2021, mostra a saga na obtenção dessa resposta, um tema muito caro a biologia molecular.

A própria Science, escolheu o tema sobre “a separação de fases” como vice-campeã na edição Breakthrough of the Year de 2018.

Foto do texto: Grânulos P (verdes), bolsões de proteína e RNA em embriões de vermes iniciais que marcam onde os espermatozoides ou óvulos irão surgir, tornaram-se o exemplo clássico de regiões separadas por fase no citoplasma.

 

Boa leitura!

Combo : Princípios e Gestão de Tecnologia em Saúde

Ciência desleixada ou ideia inovadora? A teoria de como as células organizam os conteúdos divide os biólogos

Por Mitch Leslie21 de janeiro de 2021, 14h10

Por 7 anos como presidente do Howard Hughes Medical Institute, Robert Tjian ajudou a direcionar centenas de milhões de dólares para cientistas que investigavam ideias provocativas que poderiam transformar a biologia e a biomedicina. Portanto, o bioquímico ficou intrigado alguns anos atrás quando seu aluno de graduação David McSwiggen descobriu dados que provavelmente estimulariam o entusiasmo sobre um processo chamado separação de fases, que já é um dos conceitos mais importantes da biologia celular.

Os defensores da separação de fases afirmam que proteínas e outras moléculas se auto-organizam em estruturas mais densas dentro das células, como gotas de óleo se formando na água

Essa classificação espontânea, afirmam os proponentes, serve como um mecanismo anteriormente não reconhecido para organizar o conteúdo da célula e reunir as moléculas necessárias para desencadear eventos celulares importantes

McSwiggen encontrou indícios de que a separação de fases ajuda os herpes vírus a se replicarem dentro das células infectadas, acrescentando que o processo desempenha um papel em funções tão diversas como ligar genes, ancorar o citoesqueleto e reparar DNA danificado. “É bastante claro que esse processo está em ação em toda a célula”, diz o biofísico Clifford Brangwynne, da Universidade de Princeton.

A indústria farmacêutica está tão animada quanto alguns pesquisadores acadêmicos, dados os estudos que ligam a separação de fases ao câncer, esclerose lateral amiotrófica (ELA), diabetes e outras doenças

A Dewpoint Therapeutics, uma startup que busca tratamentos médicos voltados para gotículas celulares, assinou recentemente acordos de desenvolvimento no valor de mais de US $ 400 milhões com os gigantes farmacêuticos Merck e Bayer. E três outras empresas que buscam explorar o processo abriram suas portas no final do ano passado. Refletindo esse entusiasmo, a Science escolheu a separação de fases como vice-campeã na edição Breakthrough of the Year de 2018 

Tjian diz que foi agnóstico no início sobre a importância do processo, mas, depois que as descobertas de McSwiggen o inspiraram e seus colegas a examinar mais de perto a gama de alegações, os pesquisadores começaram a ter dúvidas. Tjian e um grupo de biólogos igualmente céticos agora argumentam que a evidência de que condensados ​​semelhantes a líquidos surgem naturalmente nas células é amplamente qualitativa e obtida com técnicas que produzem resultados ambíguos – em resumo, eles acreditam que grande parte da pesquisa é de má qualidade.

Além disso, a alegação de que essas gotículas intracelulares desempenham papéis importantes “passou de dogma hipotético a estabelecido sem dados“, diz Tjian, que deixou o cargo de presidente da Howard Hughes em 2016 e agora co-dirige um laboratório na Universidade da Califórnia (UC Berkeley. “Isso para mim é tão perverso e destrutivo para o processo de descoberta científica. ”

Embora os proponentes da separação de fases se refreiem com algumas dessas críticas, muitos cientistas concordam que a pesquisa requer uma sacudida de rigor. “Não acho que todo o campo seja besteira”, diz a biofísica Stephanie Weber, da Universidade McGill. “Mas precisamos ser mais cuidadosos” na identificação de instâncias de separação de fases nas células e na atribuição de funções a elas.

O processo pode ser menos importante do que muitos cientistas afirmam agora, acrescenta a bióloga celular quantitativa Amy Gladfelter, da Universidade da Carolina do Norte, Chapel Hill, alguns pesquisadores, diz ela, tentaram torná-lo “a resposta para tudo”.

A SEPARAÇÃO DE FASES PODE RESPONDER A uma questão fundamental que incomoda os biólogos há mais de 100 anos: como as células organizam seu conteúdo de forma que as moléculas necessárias para realizar um trabalho específico estejam no lugar certo na hora certa? Uma maneira óbvia é com membranas internas, como aquelas que cercam os corpos de Golgi e as mitocôndrias. Ainda assim, muitas outras estruturas celulares bem conhecidas, incluindo o nucléolo – uma organela dentro do núcleo – e os corpos de Cajal que processam o RNA, não têm membranas.

A separação de fases é uma resposta atraente! 

Muitas proteínas apresentam manchas pegajosas que atraem outras proteínas do mesmo tipo ou de um tipo diferente, estudos em tubos de ensaio mostraram que, sob certas condições, como quando a concentração de proteínas sobe acima de um certo nível, as moléculas podem começar a se agrupar, formando condensados ​​em forma de gotículas. Os pesquisadores entendem melhor a mecânica das proteínas, mas os ácidos nucléicos, como o RNA, também podem se agregar às proteínas. Se o processo acontecer na célula, ele pode gerar e manter organelas e permitir funções únicas. “É um princípio que poderia explicar quantas coisas na célula e no núcleo estão organizadas”, diz o biofísico Mustafa Mir, da Universidade da Pensilvânia, que já trabalhou como pós-doutorando com Tjian.

Embora os biólogos tenham discutido um papel para as gotículas intracelulares já na década de 1890, as evidências de que são vitais começaram a se aglutinar há pouco mais de 10 anos. Brangwynne, então pós-doutorando no Instituto Max Planck de Biologia Celular e Molecular e Genética, estava rastreando grânulos P, manchas de proteína e RNA que, em embriões de nematóides, marcam as células que produzem espermatozoides e óvulos. Para observar os movimentos dos grânulos, Brangwynne espremeu gônadas de vermes que abrigam as estruturas entre duas lamelas de microscopia. Sob pressão, os grânulos de P responderam não como sólidos, mas como líquidos, fluindo ao longo da superfície do núcleo e pingando, ele e seus colegas relataram na Scienceem 2009. O comportamento aquoso dos grânulos “foi alucinante. Era tão diferente de tudo nas células ”, diz Weber, um ex-pós-doutorado de Brangwynne.

 

  1. BRANGWYNNE ET AL.,SCIENCE, 324, 5935, 1729 (2020)

Em 2012, Brangwynne e colegas viram características semelhantes de fluido no nucléolo, uma densa mistura de proteínas, RNA e DNA que fabrica ribossomos, as fábricas de proteínas da célula. No mesmo ano, o biofísico Michael Rosen, do Southwestern Medical Center da University of Texas, e colegas mostraram que três proteínas que colaboram para organizar parte do citoesqueleto formam gotículas líquidas em uma solução de tubo de ensaio. Eles descobriram que o processo acelera a montagem de um tipo de fibra esquelética in vitro – e pode fazer o mesmo na célula. 

Desde então, os cientistas relataram dezenas de exemplos de estruturas celulares que são redondas, com tendência a se fundir e tendem a formar gotas ou fluir pelas superfíciesmarcas registradas de gotículas formadas por separação de fases.

Para confirmar que um agrupamento molecular em uma célula é um líquido e não algo mais sólido, os cientistas costumam implantar uma técnica chamada recuperação de fluorescência após fotodegradação (FRAP). Usando uma célula que contém proteínas fluorescentes, os pesquisadores atingem a região em questão com um laser para escurecer as moléculas e, em seguida, rastreiam quanto tempo a fluorescência leva para se difundir de outras partes da célula. Um líquido, no qual as proteínas fluorescentes penetram facilmente, deve acender mais rapidamente do que um sólido. Outro teste envolve a aplicação de 1,6-hexanodiol, um composto que quebra algumas das interações moleculares que mantêm as gotículas juntas, para determinar se a estrutura se dissolve.

Rosen observa que três artigos publicados no ano passado na Cell oferecem algumas das evidências mais fortes para a separação de fases nas células

  • Um, do laboratório de Brangwynne, mostrou que uma proteína em particular tinha que atingir uma concentração limite nas células para permitir a formação de grânulos de estresse – organelas que aparecem durante tempos difíceis e foram atribuídas à separação de fases. 
  • Os outros dois estudos também identificaram condições de limiar para separação de fases, como um limite é um atributo do processo, os estudos fornecem “dados bons, mas não perfeitos, de que essas estruturas estão passando por separação de fases”, diz Rosen.

Os pesquisadores propõem que muitas características celulares, incluindo algumas no núcleo, se formam por meio da separação de fases:

 

P granule Balbiani, bodyP, bodyU, bodyStress granule, Signaling puncta Membrane clusters Synaptic densities RNA transport granule OPT domainPcG bodyDNA damage fociPML bodyHistone locus bodyPerinucleolar compartmentGemParaspeckleNuclear specklesCajal bodyNucleolusCleavage bodyNucleusCytoplasm

  1. ALTOUNIAN / CIÊNCIA

Muitos pesquisadores estão agora convencidos de que a separação de fases explica muitos aspectos da organização e função celular. 

Vários grupos de pesquisa relataram que o mecanismo ajuda a convocar as centenas de proteínas que realizam a transcrição, o processo de leitura do DNA para produzir as instruções do RNA para a produção de proteínas. Encurralamento molecular semelhante pode ser a base de funções, incluindo memória em moscas de fruta, respostas de células imunológicas a patógenos, silenciamento de DNA, transmissão de impulsos nervosos através de sinapses e reprodução de SARS-CoV-2, o coronavírus pandêmico.

Por outro lado, a separação de fases pode causar doenças quando dá errado, em 2018, por exemplo, a biofísica Tanja Mittag do St. Jude Children’s Research Hospital e colegas revelaram que mutações que promovem vários tipos de tumores interrompem a capacidade da proteína SPOP, que ajuda a eliminar proteínas que estimulam o crescimento de células cancerosas, de formar gotículas em soluções de tubo de ensaio. Os pesquisadores propuseram que a separação de fases é a chave para a função de limpeza do SPOP nas células, e impedi-la permite que as proteínas promotoras do câncer se acumulem.

A separação de fase defeituosa também pode estimular danos ao ajudar na formação de inclusões intracelulares tóxicas, ou globs de proteína, que se acumulam em doenças neurodegenerativas como ALS, doença de Alzheimer e doença de Parkinson. Por exemplo, em alguns pacientes com ELA, a proteína FUS sofre mutação e forma inclusões em seus neurônios. No tubo de ensaio, a proteína mutante se condensa em gotículas que se transformam em nós peludos de fibras semelhantes às inclusões. Em 2018, a bioquímica Dorothee Dormann da Universidade Ludwig Maximilian de Munique e seus colegas descobriram uma possível razão: a versão mutada do FUS ignora um guarda-costas de proteína que impede a variedade normal de passar por separação de fases e se acumular no tubo de ensaio.

NO ENTANTO, ESSA IMAGEM SATISFATÓRIA pode estar ficando turva à medida que mais pesquisadores levantam dúvidas sobre a separação de fases. Em 2019, por exemplo, cientistas organizaram um debate em Wiston House, uma mansão elegante do século 16 ao sul de Londres, em parte para ponderar se o processo ajudava a controlar a atividade genética, cerca de 30 participantes discutiram as evidências de que o processo ocorre em células com a ajuda de “champanhe à vontade”, lembra Mir, um dos apresentadores. A conclusão do grupo, diz ele, foi que o suporte para muitos casos putativos de separação de fases nas células é instável.

Tjian, que não estava na reunião, chegou a uma conclusão semelhante por causa de novos dados de McSwiggen. As primeiras evidências de McSwiggen mostraram que nas células infectadas pelo vírus do herpes, os compartimentos de replicação – grupos de proteínas e DNA que ajudam a produzir novas cópias do patógeno – são redondos e se fundem, sugerindo que resultam da separação de fases.

Depois de rastrear proteínas individuais dentro das células, no entanto, McSwiggen e colegas determinaram que as moléculas se difundem tão rapidamente pelos compartimentos quanto pelo resto do núcleo. Em um condensado verdadeiro, o aglomerado molecular deveria ter dificultado a difusão. Outros pesquisadores acharam a evidência negativa convincente quando foi publicada no final de 2019, logo após o debate na Wiston House. O estudo é “um conto de advertência realmente importante”, diz Weber.

Os resultados estimularam Tjian, McSwiggen, Mir e Xavier Darzacq, um biólogo celular que co-dirige o laboratório da UC Berkeley com Tjian, a examinar a literatura de separação de fases. Mais tarde naquele ano, em uma edição de dezembro de 2019 da Genes and Development, eles publicaram uma revisão contundente de 33 estudos que afirmavam detectar o processo nas células. Tjian diz que ficou “muito decepcionado com a qualidade dos jornais”. A evidência, escreveram ele e seus co-autores, era “frequentemente fenomenológica e inadequada para discriminar entre a separação de fases e outros mecanismos possíveis”.

Muitas vezes, afirmam ele e os outros autores da revisão, os pesquisadores que buscam a separação de fases contam com indicadores qualitativos – forma, por exemplo – em vez de dados quantitativos. Além disso, como muitas estruturas intracelulares possivelmente formadas por separação de fases são tão pequenas, elas estão próximas do que é conhecido como limite de difração dos microscópios de luz tradicionais. Como resultado, as estruturas podem parecer orbes difusas, mas sua forma real não é discernível.

Tjian e colegas também puniram os pesquisadores por muitas vezes presumirem que a concentração de proteína em uma célula é alta o suficiente para desencadear a separação de fases, em vez de realmente medi-la. A superinterpretação “é galopante” nesse tipo de pesquisa, diz Tjian.

Não acho que todo o campo seja uma besteira, mas, precisamos ser mais cuidadosos!

Stephanie Weber, Universidade McGill

Os cientistas questionaram as medições FRAP que sustentam muitas alegações de separação de fases. Nas mãos de diferentes cientistas, observou o grupo, as taxas de recuperação de FRAP para a mesma molécula podem variar de menos de 1 segundo a vários minutos, indicando que a técnica é muito variável para confirmar a separação de fases. Darzacq acrescenta que o FRAP “só mostra que você tem um líquido. Você tem líquido em toda a célula. ” Muitas das congregações que os pesquisadores identificaram com FRAP ou outras técnicas são provavelmente coleções transitórias de moléculas que duram apenas alguns segundos, dizem Darzacq e Tjian.

A revisão foi “um convite para todos nós prosseguirmos com uma análise mais cuidadosa e aprofundada dos condensados ​​celulares”, disse o biofísico molecular Sua Myong, da Universidade Johns Hopkins. Embora alguns cientistas tenham sido meticulosos, “isso não é verdade no campo”, acrescenta Rosen.

Brangwynne diz que ele também vê valor na crítica. “Eu concordo que precisamos de abordagens quantitativas. ” Por exemplo, ele concorda que os pesquisadores precisam ser mais rigorosos ao interpretar os resultados de imagem, de modo que “cada bolha limitada por difração” não seja declarada um exemplo de separação de fase.

Outros artigos recentes também levantaram dúvidas sobre casos de separação de fases. Em 2019 em Non-Coding RNA, Weber e um co-autor pesaram o suporte para a separação de fases no núcleo da célula e concluíram que os dados sólidos voltam a seu papel na formação de três estruturas, incluindo o nucléolo, mas não duas outras estruturas comumente atribuídas ao processo.

E em abril de 2020 na Molecular Cell, o biofísico Fabian Erdel do Center for Integrative Biology em Toulouse, França, e colegas publicaram uma nova investigação de heterocromatina – regiões silenciadas do genoma em que o DNA se enrola firmemente com várias proteínas. Trabalhos anteriores sugeriram que a separação de fases da proteína intracelular HP1 ajudou a esticar a heterocromatina. Mas a equipe de Erdel descobriu que o HP1 não forma gotículas líquidas estáveis ​​em células de camundongo e que o tamanho das regiões densamente compactadas do DNA não depende da quantidade da proteína.

Brangwynne e outros pesquisadores argumentam que, mesmo que algumas descobertas individuais citadas por Tjian e colegas permaneçam em disputa, o campo está progredindo em direção a resultados mais sólidos. Para fornecer um pouco do rigor dos estudos em tubos de ensaio, ele e sua equipe desenvolveram uma técnica para semear células com o que eles chamam de corelets, combinações de fragmentos moleculares que se agrupam quando expostos à luz. Os corelets desencadeiam a formação de gotículas nas células, permitindo aos pesquisadores sondar com mais precisão quais concentrações de proteínas são necessárias para a separação de fases e quais partes da molécula são necessárias para o comportamento. Até mesmo Tjian e seus colegas dão notas altas à abordagem.

Mir, que tem sido cético em relação a muitas das evidências de separação de fases, concorda que o campo parece estar se afastando do estágio de “tudo é separação de fases” para uma discussão mais matizada da formação e funções dos condensados. “É como qualquer supertendência na ciência. O barulho diminui e você fica com a verdade. ”

Para chegar a essa verdade, no entanto, os pesquisadores “precisam desesperadamente” de novas ferramentas e uma melhor compreensão das regras básicas de como os condensados ​​se formam nas células, diz Gladfelter. Os cientistas também precisam de paciência, diz ela, observando que o campo “tentou crescer e responder a tudo muito rápido”. Mas ela está confiante de que os pesquisadores acabarão descobrindo a real importância da separação de fases nas células. “Dê-nos tempo. Nós chegaremos lá. ”

Postado em: 

Doi: 10.1126 / science.abg6495

Mitch Leslie – Mitch Leslie escreve sobre biologia celular e imunologia.

Comunicação para Profissionais da Saúde 2x 62,19

 

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