Câncer pode ser causado por DNA fora dos cromossomos – TheScientist

Na última década, os pesquisadores perceberam que os tumores abrigam pedaços de DNA extracromossômico que podem levar à malignidade.

Capa: Imagens de microscopia eletrônica de varredura de células de câncer de cólon lisadas revelam DNA extracromossômico (pequenos círculos), além de cromossomos (estruturas maiores em forma de X). (Grandes manchas são núcleos intactos de outras células.) KRISTEN TURNER, CIENTISTA PRINCIPAL DA BOUNDLESS BIO; FOTOGRAFIA TIRADA QUANDO ELA ERA MEMBRO DO LABORATÓRIO MISCHEL

Paul Mischel

1 de abril de 2021

Na primavera de 2012, meus colegas e eu começamos a notar algo estranho nas células tumorais de pacientes com glioblastoma, uma forma altamente agressiva de câncer no cérebro, que estavam entrando em nossa clínica na Universidade da Califórnia, em Los Angeles.

A partir do sequenciamento genômico de seus tumores, sabíamos que eles exibiam amplificação de um oncogene promotor de crescimento específico, apesar de serem tratados com drogas destinadas a atingir esse gene, os pacientes não estavam melhorando, e quando interrogamos os genomas de seus cânceres depois que os tumores foram removidos cirurgicamente após o tratamento, vimos que eles haviam mudado.

Os tumores reduziram drasticamente o número de cópias do receptor do fator de crescimento epidérmico direcionado (EGFR), presumivelmente dando-lhes uma vantagem para escapar das drogas, e eles desenvolveram essas diferenças genéticas a uma taxa que parecia não fazer sentido – em apenas uma a duas semanas.

Normalmente, pensamos nos cânceres que evoluem ao longo de muitas divisões celulares, pois as células que carregam mudanças genéticas que fornecem uma vantagem de aptidão – como a capacidade de resistir a um tratamento específico – têm mais probabilidade de sobreviver e se dividir. Aqui, notamos uma mudança no número de cópias do gene em apenas algumas gerações.

Não havia como explicar como os tumores estavam alterando seu DNA tão rapidamente!

Ainda mais estranho, poderíamos tirar qualquer célula do tumor, e se ela tivesse níveis elevados ou indetectáveis ​​de proteína de EGFR, daria origem a um novo tumor quando cultivada em laboratório ou implantada em um camundongo. Cada um desses novos tumores exibiria, então, todo o espectro de células encontradas no tumor original, variando em seu número de cópias de EGFR, isso não faz sentido, de acordo com o que sabemos sobre genética clássica.

Seria de se esperar que tumores originados de uma célula com baixos níveis de EGFR dessem origem a um tumor com baixos níveis de EGFR, ao passo que um tumor originado de uma célula com altos níveis de EGFR daria origem a um tumor com altos níveis de EGFR. 

Em 2012, em um projeto liderado por um estudante de pós-graduação em meu laboratório chamado David Nathanson, que agora é professor associado da Universidade da Califórnia, em Los Angeles, decidimos entender por quê. Queríamos ver onde as cópias do EGFR estavam localizadas, normalmente, quando sequenciamos cânceres, trituramos um tumor e “lemos” todos os genes presentes, procurando mutações e variações no número de cópias, e então atribuímos a localização dessas alterações genéticas aos cromossomos onde esses genes estão na referência humana genoma. Mas, quando olhamos para uma célula se preparando para se dividir, o único momento em que é possível dizer onde um pedaço específico de DNA está localizado – ficamos surpresos ao descobrir que o EGFR não estava onde havíamos previsto. Na verdade, ele não estava sentado em um cromossomo, em vez disso, todos os oncogenes amplificados foram encontrados em círculos de DNA extracromossômico (ecDNA). Pudemos ver esses pedaços extras de DNA perto dos cromossomos dentro do núcleo das células cancerosas.

Quando removemos o tratamento com o inibidor de EGFR de células tumorais em cultura, o número de cópias de EGFR rapidamente se recuperou, mas, novamente, não nos cromossomos.

Quando vimos isso, percebemos que o ecDNA pode explicar por que alguns cânceres podem se tornar resistentes ao tratamento tão rapidamente, permitindo que os tumores evoluam a uma taxa que excede em muito qualquer coisa que poderia ser explicada pela genética clássica.

Publicamos nossos resultados na Science em 2014, mas eles não foram imediatamente aceitos pela comunidade, embora tivéssemos estudado apenas um tipo de tumor, o glioblastoma, começamos a nos perguntar se isso poderia ser a ponta do iceberg.

Sem perceber, este estudo nos levou, e agora a outros, a uma série de descobertas que mudaram a forma como os pesquisadores veem o câncer em geral, revelando formas assustadoras como os tumores podem evoluir.

Aprendemos que o ecDNA é fundamental para o comportamento de algumas das formas mais agressivas de câncer, permitindo níveis notavelmente elevados de transcrição de oncogene, criando novas interações regulatórias de genes e fornecendo um mecanismo poderoso para mudança rápida que pode levar a um número muito alto de cópias de oncogene ou permitir que as células cancerosas resistam ao tratamento.

Ao longo do caminho da descoberta, descobrimos que não éramos os primeiros a ver essas partículas extracromossômicas, mas, com novas ferramentas em mãos e novas questões em mente, nós as vimos de uma maneira muito diferente. E quando analisamos profundamente o núcleo das células cancerosas, vimos ecDNAs em abundância. Buscamos ansiosamente estudos para entender sua importância na progressão do câncer e na resistência aos medicamentos, e até fundamos uma empresa de biotecnologia, a Boundless Bio, para identificar e desenvolver novas maneiras de tratar pacientes cujos cânceres são causados ​​por ecDNA.

Mapas enganosos

Os humanos dependem de mapas para navegar por paisagens complexas e entender o mundo ao nosso redor, sem nossos mapas, estamos perdidos. No entanto, nossos mapas também nos limitam, se algo estiver faltando no mapa – ou pior ainda, o mapa estiver errado – podemos ser jogados fora do curso. Considere os mapas do sistema solar de Ptolomeu e Copérnico.

Ptolomeu fez medições precisas dos planetas que se moviam pelos céus, mas errou na orientação de seu mapa ao colocar a Terra no centro, demorou quase 1.500 anos para Copérnico corrigi-lo

Como os ecDNAs são distribuídos de maneira desigual entre as células-filhas, eles geram variação entre a população de células cancerosas, alimentando a seleção natural.
Veja infográfico completo: WEB | PDF

© EMMA CHENG

Os pesquisadores já fazem mapas do câncer há muito tempo, primeiro, fizemos mapas baseados em órgãos, depois mapas baseados em tipos de células, esses ainda são os mapas dominantes que os pesquisadores e médicos usam para navegar pelo câncer, mas o advento de tecnologias poderosas de sequenciamento de DNA inaugurou uma nova era de mapeamento do câncer no nível do genoma. Podemos pegar o DNA do tumor de um paciente e encontrar as mutações genéticas que são as culpadas, isso se tornou a base para o diagnóstico e tratamento do câncer, mas, como aprendemos em nosso estudo seminal há vários anos, algo estava faltando nos mapas baseados em genoma: ecDNA!

Desde 1965, os cientistas reconheceram que os elementos do ecDNA existem nas células de certos tipos de câncer , em particular o neuroblastoma . Estes elementos foram inicialmente chamados de “ corpos de cromatina minutos ”, e, em seguida, como “ duplas minutos ”, porque eles foram muitas vezes emparelhados . No final dos anos 1970 e 1980, várias equipes de pesquisa mostraram que esses minutos duplos podiam levar à amplificação do gene. Em contraste com este trabalho anterior, descobrimos que os ecDNAs nem sempre são encontrados aos pares, na verdade, os ecDNAs ocorrem como corpos emparelhados apenas 30 por cento do tempo. Portanto, para maior clareza, usamos aqui o termo “ecDNA” para descrever as partículas de ecDNA singlete e ecDNA de minuto duplo.

Até muito recentemente, apesar dos esforços para decifrar a estrutura do ecDNA, a importância dessas partículas do ecDNA permanecia obscura e, como o campo desenvolveu novas técnicas para gerar mapas de câncer ricos em informações do genoma, a maioria dos pesquisadores parou de pensar no ecDNA, que se pensava que ocorria raramente. Na verdade, de acordo com o banco de dados Mitelman das aberrações cromossômicas, o ecDNA ocorreu apenas em cerca de 1,4% dos cânceres, assim, depois de publicar nosso estudo de 2014 mostrando que o ecDNA é um evento muito comum no câncer, houve o que eu chamaria de coçar a cabeça colossal.

Eu daria palestras sobre o trabalho e as pessoas diriam, por exemplo: “Engraçado, o gene causador do câncer que estou estudando está no cromossomo 8”, eu então perguntaria como eles sabiam disso e me apresentariam uma cópia de um mapa do câncer baseado no genoma de referência humano. Percebi que podemos estar olhando para um mapa de “Ptolomeu”!

Como os ecDNAs podem impulsionar a evolução do câncer

Em contraste com o DNA cromossômico, que é replicado e dividido igualmente entre as células filhas durante a divisão celular, o DNA extracromossômico (ecDNA) encontrado em algumas células cancerosas nem sempre é dividido igualmente. Na falta de centrômeros, esses pedaços circulares de DNA são freqüentemente divididos de forma desigual em células-filhas. Algumas células-filhas recebem mais ecDNA, que depois duplicam, de modo que o número de cópias dos oncogenes nessas células aumenta rapidamente. Além disso, como cada divisão celular é essencialmente um “cara ou coroa” em relação à herança do ecDNA, a variação entre a população de células cancerosas é preservada, fornecendo um amplo suprimento do combustível necessário para a seleção natural. Essas duas características em combinação podem permitir que os cânceres que contêm ecDNA evoluam muito mais rapidamente do que os cânceres sem ecDNA.

Apreciando DNA extracromossômico

Depois que nosso artigo na Science foi publicado, comecei a trabalhar em estreita colaboração com Vineet Bafna, um cientista da computação da Universidade da Califórnia, San Diego, que desempenhou um papel fundamental na decodificação do genoma humano. Em um estudo liderado por uma pesquisadora do meu laboratório chamada Kristen Turner (agora na Boundless Bio), junto com os cientistas da computação Viraj Deshpande e Doruk Beyter do grupo de Bafna, integramos o antigo com o novo – modernos kits de ferramentas genômicas, poderosos de próxima geração sequenciamento, métodos computacionais avançados e visualização sob o microscópio das localizações do ecDNA.

Este trabalho revelou a presença de ecDNA em quase todos os tipos de câncer que examinamos, descobrimos ainda que o ecDNA permite que os cânceres mudem seus genomas rapidamente e até mesmo movam os genes de volta para os cromossomos, mas não em seus locais originais.

No início de 2017, dei um seminário sobre essas descobertas na Universidade de Stanford, onde conheci Howard Chang, um médico-cientista que havia desenvolvido técnicas para analisar a arquitetura da cromatina e a estrutura epigenética das células cancerosas. Chang havia descoberto recentemente mudanças importantes na estrutura da cromatina no câncer que permitem um maior acesso da maquinaria transcricional ao DNA para conduzir a transcrição. Depois da minha palestra, discutimos como o ecDNA pode gerar um padrão de cromatina muito mais aberto, permitindo a transcrição aprimorada de oncogenes, de acordo com o que Chang estava descobrindo. Trabalhando em estreita colaboração com Chang, bem como com Bafna e a Universidade da Califórnia, Bing Ren de San Diego, meus colegas de pós-doutorado Turner, Sihan “Sean” Wu e Nam Nguyen decidiram compreender melhor a estrutura do ecDNA e suas consequências transcricionais.

Demonstramos pela primeira vez que o ecDNA é circular, esses ecDNAs diferem das pequenas partículas circulares extracromossômicas mais comuns (eccDNAs) que são encontradas nos genomas de eucariotos de levedura a moscas e humanos. Por um lado, os eccDNAs têm em média apenas cerca de 100-1.000 pares de bases de comprimento e, portanto, é relativamente improvável que contenham genes intactos ou outros elementos funcionais, enquanto os ecDNAs são relativamente grandes, com média de cerca de 1,3 milhão de pares de bases. Os ecDNAs estão repletos de oncogenes promotores de crescimento e contêm outros genes e regiões regulatórias que podem estar envolvidos na formação e progressão do tumor.

O DNA extracromossômico é identificado nesta imagem de microscopia eletrônica de varredura de cor falsa de células cancerosas de cólon lisadas. (Grandes manchas são núcleos intactos de outras células.)

KRISTEN TURNER, CIENTISTA PRINCIPAL DA BOUNDLESS BIO; FOTOGRAFIA TIRADA QUANDO ELA ERA MEMBRO DO LABORATÓRIO MISCHEL

Além disso, ao contrário de outros tipos de pequenos DNAs circulares, como eccDNAs e DNAs ribossomais, que podem ser encontrados em células normais em níveis baixos, os ecDNAs são exclusivos do câncer e são altamente amplificados. E, como todos os DNAs circulares não têm os centrômeros usados ​​para segregar cromossomos homólogos, eles geralmente não são divididos igualmente entre as células-filhas após a divisão celular. Isso permite que os cânceres com ecDNA evoluam rapidamente, acumulando muitas cópias de genes causadores de câncer ou reduzindo o número de oncogenes direcionados a medicamentos, enquanto mantém a variabilidade célula a célula que impulsiona a evolução acelerada do tumor e a resistência aos medicamentos. (Veja a ilustração acima.)

A estrutura tridimensional do ecDNA também contém pistas sobre seu papel em alguns tipos de câncer, ao combinar microscopia ultraestrutural e sequenciamento do genoma inteiro com reconstrução computacional e mapeamento óptico de DNA de longo alcance no qual fragmentos muito longos de DNA, às vezes mais de 150.000 pares de bases, podem ser resolvidos, meus colaboradores e eu mostramos que ecDNAs são circulares e que o DNA é enrolado em torno de núcleos de histonas em nucleossomos como o DNA cromossômico, mas de uma forma altamente anormal. A cromatina do ecDNA exibe um grau significativamente menor de compactação em comparação com os mesmos segmentos de DNA que se reintegram nos cromossomos, sugerindo que a forma alterada do DNA pode contribuir ativamente para a transcrição de oncogenes encontrados no ecDNA. (Veja a ilustração abaixo.)

FOTO 4 Como os ecDNAs podem apoiar o crescimento canceroso

A natureza circular dos ecDNAs pode permitir interações gênicas que podem suportar o aumento da transcrição de oncogenes, já que elementos genéticos normalmente encontrados em partes distantes do genoma podem se unir para interagir. Enquanto os isoladores no DNA cromossômico ficam na haste de uma estrutura de alça e garantem que as sequências regulatórias, como os potenciadores, funcionem apenas em seus genes-alvo próximos, a forma circular do ecDNA gera novas interações com sequências regulatórias adicionais que normalmente não ocorreriam no DNA cromossômico.

FOTO 5 (abaixo) Elementos reguladores adicionais podem suportar uma expressão de oncogene mais alta. © EMMA CHENG Além disso, os ecDNAs tendem a ter uma estrutura de cromatina mais aberta do que os cromossomos que promovem o aumento da expressão gênica. O DNA é enrolado em torno dos núcleos das histonas em unidades de organização chamadas nucleossomos. Nos cromossomos, algumas regiões podem se tornar altamente compactadas, tornando o DNA inacessível à maquinaria transcricional, mas os ecDNAs têm uma estrutura de cromatina alterada na qual os nucleossomos não se compactam, resultando em DNA altamente acessível que é preparado para a transcrição. Além disso, os ecDNAs são carregados com marcas ativas de histonas, mas têm uma escassez de marcas repressivas de histonas, promovendo altos níveis de transcrição.

O arranjo de cromatina aberta também pode suportar a expressão de oncogene. © EMMA CHENG Veja infográfico completo: WEB | PDF

Na verdade, também descobrimos que o ecDNA é carregado com modificações de cromatina que promovem a transcrição e tem uma escassez de marcas de cromatina repressivas, sugerindo que está preparado para altos níveis de expressão gênica. Além disso, descobrimos que a cromatina do ecDNA é bem organizada em alças que normalmente são uma parte importante da regulação do gene, mas com uma topologia tridimensional que é distinta daquela do DNA cromossômico. À medida que o segmento de DNA se torna circular, em um processo ainda não completamente compreendido, os elementos distais do DNA são colocados em proximidade, permitindo a interação da cromatina de alcance ultralongo que não pode ser alcançada pelo DNA cromossômico. Isso poderia formar novos circuitos reguladores de genes, incluindo novos contatos ativos que conduzem a transcrição oncogênica.

Consistente com essas descobertas, Publicamos esses resultados na Nature em novembro de 2019, e o artigo foi destacado em uma história de Carl Zimmer no The New York Times. Logo depois disso, dois outros grupos – um liderado por Peter Scacheri da Cleveland Clinic e Case Western Reserve University e Jeremy Rich da University of California, San Diego, e outro por Anton Henssen do Charité Hospital em Berlim e Richard Koche do Memorial Sloan Kettering Cancer Center – acrescentou mais evidências de que os ecDNAs podem desempenhar um papel fundamental na reorganização do controle transcricional dos genomas do câncer, trazendo elementos reguladores codificados no ecDNA em contato com genes com os quais eles nunca interagiriam nos cromossomos.

Um trabalho recente de Chang, em colaboração comigo, Bafna e Henssen, começou a sugerir uma nova maneira muito empolgante de como essas peças circulares de DNA, em vez de agirem sozinhas, costumam se organizar em corpos nucleares chamados centros de ecDNA. Esses hubs são amarrados por proteínas e parecem fornecer uma plataforma para a transcrição cooperativa, na qual os ecDNAs trabalham juntos para conduzir a expressão de genes promotores do câncer.

A questão então passou a ser: como podemos capitalizar essa nova compreensão do ecDNA para melhorar os resultados dos pacientes? 

Em 2018, Chang, Bafna e eu, com outros cientistas, fundamos o Boundless Bio, onde vários cientistas da equipe agora buscam a resposta para essa pergunta.

Traduzindo ecDNA para aplicação clínica

Trabalhando em estreita colaboração com Chang, Bafna e Roel Verhaak do Laboratório Jackson (também co-fundador da Boundless Bio), estamos tentando entender algumas das implicações clínicas do ecDNA.

Bancos de dados publicamente disponíveis, incluindo The Cancer Genome Atlas e Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes, contêm um grande número de sequências do genoma inteiro de amostras de câncer, rendendo uma oportunidade de ouro para a descoberta.

Aplicamos o AmpliconArchitect, uma ferramenta desenvolvida pela Bafna que procura os sinais reveladores do ecDNA em dados de sequenciamento do genoma inteiro, incluindo regiões amplificadas que são mapeadas para um círculo, e então usa algoritmos que deconvoluem essas estruturas circulares.

Isso nos permitiu analisar a frequência e a composição estrutural potencial do ecDNA em mais de 3, 200 amostras de câncer de uma ampla variedade de tipos histológicos ao lado de sangue total e tecido normal correspondentes.

Nossas descobertas indicaram que o ecDNA é exclusivo do câncer e que, no mínimo, 14% dos tumores humanos, incluindo algumas das formas mais malignas de câncer, abrigam o ecDNA.

Além disso, descobrimos que os pacientes cujos cânceres têm ecDNA têm sobrevida significativamente menor do que os pacientes com câncer cujos tumores são causados ​​por lesões no DNA cromossômico.

Resta saber como comumente os ecDNAs desempenham um papel na evolução da resistência aos medicamentos, como vimos em nosso estudo inicial, muitas outras questões permanecem também. Estudos recentes lançaram luz sobre como o ecDNA pode se formar, embora nós e outros suspeitemos fortemente que pode haver várias rotas para seu desenvolvimento.

O problema do ecDNA no câncer e o desafio que ele representa tornaram-se claros, o National Cancer Institute e o Cancer Research UK designaram recentemente o ecDNA como um dos Grandes Desafios do Câncer que deve ser abordado. 

É emocionante ver o interesse crescente e um influxo de pesquisadores talentosos com o objetivo de decifrar os principais aspectos da biologia do ecDNA, estamos ansiosos para o desenvolvimento de novas ferramentas, novas colaborações e novos tratamentos para pacientes! 

Joshua Lederberg escreveu em seu importante artigo de 1952 na Physiological Reviews: “Eu proponho plasmídeo como um termo genérico para qualquer determinante hereditário extracromossômico”.

Nas bactérias, os plasmídeos circulares são um mecanismo poderoso para obter vantagem seletiva, pois permitem uma evolução rápida, incluindo resistência aos medicamentos.

Da mesma forma, leveduraservas daninhas e até mesmo parasitas podem escapar de drogas e toxinas ambientais codificando genes de resistência no DNA extracromossômico circular. Os ecDNAs podem fazer o mesmo com o câncer, fornecendo um veículo potente para a evolução rápida do tumor que maximiza as variantes genéticas oncogênicas críticas – ou as reduz para desenvolver resistência aos medicamentos.

Assim como os exploradores confiam nos mapas da Terra e os astrônomos nos mapas da galáxia, os biólogos do câncer dependem dos mapas para navegar nas complexidades do câncer, agora sabemos que há muito perdíamos um elemento crítico. Portanto, aqui estamos nós mais uma vez, como cartógrafos fisiológicos, arregaçando as mangas e fazendo novos mapas topograficamente informados do câncer para nos ajudar a navegar na doença multifacetada e desenvolver novos e mais eficazes tratamentos para os pacientes.

Paul Mischel é professor e vice-presidente de pesquisa do Departamento de Patologia da Escola de Medicina da Universidade de Stanford e bolsista do Instituto ChEM-H da Universidade de Stanford. 

Palavras-chave:

Câncer biologia do câncer expressão do gene do câncer genômica do câncer biologia celular e molecular regulação gênica genética, genética e genômica oncogene

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https://www.the-scientist.com/features/cancer-may-be-driven-by-dna-outside-of-chromosomes-68590

 

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